Premessa

Emofilia A ed emofilia B sono state a lungo considerate, da un punto di vista clinico, la stessa malattia, differendo unicamente per il fattore della coagulazione mancante a livello plasmatico (FVIII e FIX, rispettivamente). Alcuni Autori hanno recentemente descritto una minore necessità di profilassi e chirurgia ortopedica in pazienti affetti da emofilia B grave, rispetto a quelli che presentano emofilia A. In una nostra precedente ricerca, i cui risultati sono stati appena pubblicati (8), abbiamo mostrato come il principale determinante della tendenza all’emorragia in pazienti affetti da emofilia grave sia il tipo di mutazione dei geni codificanti per FVIII e FIX. Inoltre, i risultati di questa ricerca hanno indicato come i soggetti con emofilia B manifestino meno episodi emorragici e una malattia nel complesso meno invalidante rispetto a quelli affetti da emofilia A. Tuttavia, nello studio appena descritto avevamo arruolato solo 11 soggetti con emofilia B: i risultati ottenuti, pertanto, devono trovare eventuale conferma in una più ampia popolazione di pazienti.

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Centro Coordinatore
santagostino

Dott.ssa Elena Santagostino
Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico
Dip. di Medicina Interna • U.O.S.D. Emofilia e Trombosi • “Angelo Bianchi Bonomi”
Via Pace, 9 • 20122 • Milano

Centri Satelliti
rocino

Dott.ssa Angiola Rocino
Centro delle Microcitemie • Ospedale san Giovanni Bosco • U.O.C di Ematologia
Via F.M. Briganti, 255 • 80144 • Napoli

 

massimo-morfini

 

Dr. Massimo Morfini
Azienda Ospedaliera “Careggi” • Centro Emofilia
Viale G.B. Morgagni, 85 • 50134 • Firenze

20 Ottobre 2010

Studio: “Determinanti clinici e molecolari dell’espressione fenotipica dell’emofilia grave di tipo A e B”

Responsabile dello studio:

Dott.ssa Elena Santagostino, U.O.S. Emofilia, IRCCS Ospedale Ca’ Granda Policlinico

NOTA: Per ulteriori informazioni si rimanda al protocollo completo. Numero di protocollo: WS1274746

Tipo di studio: di coorte nazionale, multicentrico, retrospettivo, non farmacologico, biologico

Condizione/Malattia: Pazienti di sesso maschile con Emofilia A & Emofilia B

Informazioni indicative

Numero di pazienti: 50

Durata della partecipazione dei pazienti: circa 2 anni

Centri coinvolti: 3

Durata dello studio: 2 anni

Razionale: Emofilia A ed emofilia B sono state a lungo considerate, da un punto di vista clinico, la stessa malattia, differendo unicamente per il fattore della coagulazione mancante a livello plasmatico (FVIII e FIX, rispettivamente). Alcuni Autori hanno recentemente descritto una minore necessità di profilassi e chirurgia ortopedica in pazienti affetti da emofilia B grave, rispetto a quelli che presentano emofilia A. In una nostra precedente ricerca, i cui risultati sono stati appena pubblicati (8), abbiamo mostrato come il principale determinante della tendenza all’emorragia in pazienti affetti da emofilia grave sia il tipo di mutazione dei geni codificanti per FVIII e FIX. Inoltre, i risultati di questa ricerca hanno indicato come i soggetti con emofilia B manifestino meno episodi emorragici e una malattia nel complesso meno invalidante rispetto a quelli affetti da emofilia A. Tuttavia, nello studio appena descritto avevamo arruolato solo 11 soggetti con emofilia B: i risultati ottenuti, pertanto, devono trovare eventuale conferma in una più ampia popolazione di pazienti.

Il presente studio è pensato per valutare i determinanti clinici e laboratoristici di una possibile lieve manifestazione clinica dell’emofilia B grave e determinare l’esistenza di differenze rispetto all’emofilia A di pari gravità. L’identificazione di markers predittivi della gravità clinica dell’emofilia può essere utile per l’identificazione dei pazienti che possono trarre reale beneficio da una profilassi primaria, una procedura generalmente iniziata già nell’infanzia, con i ben noti problemi legati all’accesso venoso. Lo studio includerà pazienti con emofilia grave di tipo A o B (FVIII o FIX < 1 UI/dl), naïve per inibitori.

L’identificazione di differenti fenotipi emorragici in pazienti con emofilia A o emofilia B può determinare benefici concreti per il management clinico di queste patologie.

In particolare, lo sviluppo di artropatia cronica è strettamente correlato alla frequenza di emorragia; l’obiettivo primario dei regimi profilattici è la prevenzione dell’artropatia, da perseguire attraverso la riduzione o la soppressione del sanguinamento a livello articolare. Nei pazienti affetti da emofilia grave, la profilassi primaria dovrebbe essere iniziata già nell’infanzia: questa necessità pone alcuni problemi pratici, come l’accesso venoso in soggetti di così giovane età e il training dei genitori per consentire un trattamento domiciliare. Inoltre, il consumo di concentrati rappresenta un altro elemento di criticità, in particolare nei Paesi in via di sviluppo. Su queste basi, l’identificazione dei fattori associati a un fenotipo emorragico lieve potrebbe aiutare i clinici nell’ottimizzazione della profilassi e del consumo di risorse, adeguando il regime terapeutico al pattern di sanguinamento previsto. Infatti, nei pazienti con un fenotipo emorragico lieve, e un minor rischio di sviluppo di artropatia cronica, è possibile procrastinare l’instaurarsi di una terapia profilattica: questo permette di evitare sia iniezioni regolari in pazienti così giovani sia l’allestimento di un accesso venoso alternativo, riducendo al tempo stesso il consumo totale di fattori.

Infine, la possibilità di identificare i possibili fattori che rendono il rischio di emorragia meno marcato nei pazienti affetti da emofilia grave di tipo B, rispetto a quelli con il tipo A, permetterà una migliore comprensione dei differenti meccanismi biochimici dell’emostasi per le due patologie, consentendo quindi un ulteriore sviluppo della ricerca clinica su nuovi farmaci emostatici.

Obbiettivi:

L’obiettivo primario di questo studio è determinare l’esistenza di un’eventuale differenza nelle manifestazioni cliniche e nel profilo coagulativo tra pazienti affetti da emofilia grave di tipo A (FVIII <1 UI/dl) o tipo B (FIX: <1 UI/dl) e se queste caratteristiche fenotipiche possano essere correlate al tipo di mutazioni nei geni codificanti per FVIII o FIX.

Gli altri obiettivi includono:

– Descrivere la diatesi emorragica, definita dalla frequenza annua di sanguinamenti e la natura (sito e gravità) degli episodi emorragici in pazienti affetti da emofilia B grave.

– Valutare lo status ortopedico (clinico e radiologico), compresa la necessità di chirurgia ortopedica, in pazienti con emofilia B grave.

– Descrivere i regimi terapeutici adottati (al bisogno o profilassi) e il corrispondente consumo di fattori in pazienti con emofilia B grave, e stimare la percentuale di pazienti sottoposti a profilassi primaria. L’ampia maggioranza della letteratura pubblicata su questi temi, infatti, si riferisce a pazienti con emofilia grave di tipo A.

Infine, un ulteriore obiettivo specifico di questo progetto è l’identificazione dei test di laboratorio o dei markers che possono permettere di predire il fenotipo clinico, in modo da poter avanzare alcune ipotesi sui meccanismi molecolari specifici responsabili della modulazione della diatesi emorragica in differenti gruppi di pazienti. In particolare, saranno valutati:

La capacità di generazione della trombina, definita come il potenziale endogeno di trombina (endogenous thrombin potential, ETP), in pazienti affetti da emofilia grave di tipo A o B.

Il ruolo delle piastrine nelle manifestazioni cliniche di questi soggetti.

Il ruolo delle microparticelle contenenti fattori tissutali o piastrino-derivate come marker dell’attivazione della coagulazione in pazienti con emofilia grave di tipo A o B.

Disegno dello studio:

Si tratta di uno studio nazionale di coorte nazionale, multicentrico, retrospettivo, non farmacologico, biologico coordinato dal Centro Emofilia e Trombosi Angelo Bianchi Bonomi di Milano, che include tutti i pazienti di sesso maschile affetti da emofilia grave di tipo A o B per i quali sono disponibili informazioni dettagliate sulle manifestazioni cliniche. L’ultimo rapporto pubblicato dal Registro Italiano dell’Emofilia includeva 1364 pazienti con emofilia grave di tipo A e 231 con emofilia grave di tipo B (14). Sarà effettuato uno studio nested (o nidificato) caso-controllo, per identificare i potenziali predittori di una tendenza al sanguinamento lieve, considerando come casi i pazienti con emofilia B e come controlli quelli con emofilia A. Per ciascun caso, saranno identificati almeno 2 controlli age-matched per valutare potenziali differenze nel trattamento. Saranno inclusi nello studio almeno 50 pazienti con emofilia di tipo B grave, con i rispettivi controlli. Lo studio prevede che, previa firma del modulo di consenso informato, il paziente esegua una visita di screening in cui verranno raccolti tutti i dati retrospettivi ed in occasione della quale sarà sottoposto la prelievo di sangue routinario, dal quale verrà stoccata una parte di sangue per eseguire i test di laboratorio descritti nel protocollo. Qualora il paziente no sia in wash out terapeutico da almeno 5 giorni, il prelievo verrà posticipato.

Criteri di inclusione:

  1. Pazienti di sesso maschile, affetti da emofilia grave di tipo A o B (FVIII/FIX <1 UI/dl), di qualunque età.
  2. Consenso informato firmato e datato, relativamente alla raccolta dei dati e al prelievo di sangue, prima dell’inclusione nello studio, che verrà comunque svolto come da prassi clinica.

Criteri di esclusione:

  1. Pazienti di sesso femminile
  2. Pazienti con precedente consumo di inibitori, o in terapia con queste molecole.
  3. Pazienti per i quali non era possibile un wash-out di almeno 5 giorni dall’ultima infusione di concentrato per il prelievo di sangue.
  4. Presenza di ogni condizione in grado di compromettere la capacità del paziente di attenersi alle procedure previste dallo studio, o in grado di rappresentare una controindicazione per la partecipazione ad esso, come per esempio storia medica non adeguata o attesa di modesta compliance in base alla documentazione disponibile.
  5. Mancanza di volontà o incapacità di seguire le procedure indicate nel protocollo.

Metodi

Studio nazionale di coorte, coordinato dal Centro Emofilia e Trombosi Angelo Bianchi Bonomi di Milano, che include tutti i pazienti di sesso maschile affetti da emofilia grave di tipo A o B (FVIII/FIX <1 UI/dl) per i quali sono disponibili informazioni dettagliate sulle manifestazioni cliniche.

Sarà effettuato uno studio nested (o nidificato) caso-controllo, per identificare i potenziali predittori di una tendenza al sanguinamento lieve, considerando come casi i pazienti con emofilia B e come controlli quelli con emofilia A.

Definizione del fenotipo emorragico: il fenotipo emorragico sarà definito su base clinica, considerando l’età al primo episodio emorragico e alla prima emorragia a livello articolare, l’età all’inizio della profilassi, la frequenza annuale di sanguinamento, il consumo annuale di concentrati, lo status ortopedico e la necessità di chirurgia ortopedica.

Lo status ortopedico sarà definito per mezzo di scores clinici e radiologici: in particolare, saranno utilizzati l’Hemophilia Joint Health Score (HJHS) e l’Orthopedic Joint Score per valutare lo status articolare rispettivamente nei pazienti pediatrici e negli adulti. Sarà inoltre utilizzato il Pettersson Score per valutare lo status radiologico delle articolazioni (per un elenco di tutti gli scores utilizzati, si rimanda al protocollo completo). Saranno considerati dati sugli scores clinici delle articolazioni ottenuti entro un anno precedentemente all’inclusione nello studio e gli scores radiologici ottenuti entro 5 anni dallo stesso timepoint, quando disponibili; altrimenti, queste informazioni saranno raccolte al momento dell’ingresso nello studio (Screening o visita successiva).

Dosaggi di laboratorio:

Tutti i dosaggi di laboratorio saranno effettuate centralmente, presso il Centro di Milano; ogni altro Centro partecipante dovrà preparare e inviare 5-7 aliquote, ciascuna contenente 1 ml di plasma congelato. A tal scopo, saranno prelevati campioni di sangue, che saranno quindi processati secondo due procedure differenti, descritte nel protocollo completo, per ottenere rispettivamente campioni di plasma povero di piastrine (platelet-poor plasma) e plasma ricco di piastrine (platelet-rich plasma).

Test di coagulazione:

I test di coagulazione previsti per questo studio includono la misurazione della concentrazione di FVIII e FIX, il dosaggio cromogenico di FVIII e FIX e quello degli antigeni di questi fattori. Tutte le procedure di misurazione sono descritte nel dettaglio nel protocollo completo.

Capacità di generazione della trombina

Il test sarà effettuato secondo il metodo di Hemker e collaboratori, descritto nel dettaglio da Chantarangkul et al (vedi bibliografia riportata nel protocollo completo). Ulteriori informazioni circa le procedure utilizzate per questo test sono disponibili nel protocollo completo.

Saggio di generazione della trombina con piastrine lavate

Il test di generazione della trombina sarà effettuato, in un sottogruppo di pazienti, con l’aggiunta di piastrine lavate da controlli sani a campioni di platelet-poor plasma e viceversa. Si rimanda al protocollo completo per ulteriori indicazioni sulla preparazione dei campioni necessari per questo test.

Microparticelle

Le microparticelle saranno analizzate relativamente alle dimensioni e alla fluorescenza e le conte delle microparticelle saranno espresse come unità/μl di plasma, in accordo con la letteratura (vedi bibliografia). Si rimanda al protocollo completo per ulteriori indicazioni sulla preparazione dei campioni necessari per questo test.

Analisi molecolari:

Le analisi molecolari includeranno il genotipo di FVIII, FIX, del Fattore V G1691A (Fattore di Leiden) e le mutazioni del gene per la protrombina G20210A, rilevati con i metodi descritti nel protocollo completo.

Caratterizzazione dei livelli di espressione FVIII/FIX nei pazienti

L’attività FVIII/FIX sarà testata con il test fluorogenici di generazione di FXa e di trombina.
I livelli e i tipi di proteina FIX saranno valutate mediante test ELISA e Western blotting.
La presenza di mRNA ectopico dei FVIII/FIX e l’eventuale NMD (Nonsense Mediated mRNA DECAY) saranno valutati mediante il test real-time RT-PCR in tutti i pazienti e nelle portatrici femminili.

Caratterizzazione dei livelli di espressione in modelli cellulari

Le varianti no-sense FIX saranno espresse transitoriamente tramite cellule embrionali umane Kydney (HEK293) per la valutazione dei livelli di rFIX nel lisato cellulare secreto tramite il test ELISA e Western blotting. Le mutazioni saranno inserite nel fattore umano FIX in cui il cDNA è stato clonato nel vettore pCMV5-FIX

Analisi statistica:

Le variabili continue saranno espresse come mediana/range interquartile (interquartile ranges, IQR) e saranno confrontate con il test U di Mann-Whitney o il test t di Student. Le variabili categoriche saranno espresse come frequenza e valori percentuali e saranno confrontate mediante test del chi-quadrato o il test esatto di Fisher. Saranno inoltre utilizzate la regressione logistica univariata e quella multivariata per valutare i fattori indicativi di una tendenza al sanguinamento lieve, con il calcolo degli odds ratio crudi e aggiustati e dei relativi intervalli di confidenza al 95%. Un valore di p <0,05 sarà considerato come statisticamente significativo. Tutte le analisi statistiche saranno effettuate mediante il SPSS Software, versione 17.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois).

Considerazioni etiche: Questo studio sarà condotto in accordo con le leggi e le regolamentazioni vigenti, che includono (ma non sono limitate a) le Linee Guida dell’International Conference on Harmonisation (ICH) per la buona pratica clinica (Good Clinical Practice, GCP) e i principi etici definiti nella Dichiarazione di Helsinki. Un Comitato Etico indipendente dovrà valutare ed esprimersi sul protocollo e sulle procedure di consenso informato precedentemente all’inclusione del primo paziente nello studio. Inoltre, prima dell’esecuzione di una qualunque procedura descritta nel protocollo, i pazienti o il loro tutore legale devono firmare e datare il modulo di consenso informato approvato dal Comitato Etico.

Flowchart dello studio

Procedure dello studio
Intervallo

Giorno 1

Giorno xx*

Tipo di visita

Screening

Basale

Consenso informato

X

Criteri di inclusione e di esclusione

X

Caratteristiche demografiche, storia clinica, informazioni su emofilia A o B

X

Esame obiettivo/segni vitali

X

Prelievo di sangue (a)

X

Platelet-rich plasma (b)

X

Platelet-poor plasma (c)

X

Saggio di coagulazione (d)

X

Analisi molecolare (e)

X

Status ortopedico clinico

X (f)

X (f)

Status ortopedico radiologico

X (g)

X (g)

Definizione del fenotipo (h)

X

Eventi avversi

X

X

 

Giorno* : il giorno in cui verrà eseguito il prelievo di sangue qualora il paziente non fosse in wash out da almeno 5 giorni dall’ultima infusione.

 

(a) I campioni di sangue saranno prelevati con venipuntura sterile, dopo un periodo di wash-out pari ad almeno 5 giorni dall’ultima infusione di concentrato, e saranno raccolti come riportato nel protocollo, in tubi da prelievo sottovuoto (Becton and Dickinson, Meylan, Francia). Il sangue sarà centrifugato entro 30 minuti dal prelievo, a temperatura ambiente controllata, mediante due procedure differenti per ottenere rispettivamente platlet-poor plasma o platelet-rich plasma.

(b) Centrifugazione per 5 minuti a 150g (temperatura ambiente controllata), per ottenere platelet-rich plasma. La generazione di trombina sarà valutata entro due ore dalla preparazione del platlet-rich plasma.

(c) Centrifugazione per 20 minuti a 2880g (temperatura ambiente controllata) e separazione del platelet-poor plasma, che sarà partizionato, congelato rapidamente in azoto liquido e conservato a -70° C fino a test convenzionale di coagulazione, test di generazione della trombina e conta delle microparticelle.

(d) Per misurare: concentrazione di FVIII/FIX, dosaggio cromogenico di FVIII/FIX, antigeni di FVIII e FIX, saggio di generazione della trombina e saggio di generazione della trombina con microparticelle lavate, secondo quanto descritto nel protocollo.

(e) Per valutare il genotipo di FVIII, FIX, del Fattore V G1691A (Fattore di Leiden), e le mutazioni della protrombina G20210A, come descritto nel protocollo.

(f) Non necessario qualora siano disponibili dati ottenuti entro un anno precedentemente all’ingresso nello studio, altrimenti da eseguire alla prossima visita.

(g) Non necessario qualora siano disponibili dati ottenuti entro i 5 anni precedenti all’ingresso nello studio, altrimenti da eseguire alla prossima visita.

(h) Secondo quanto riportato in Santagostino et. al, JTH 2010, Apr; 8(4): 737-743.