Ruolo dell’indolamina 2-3 diossigenasi nella tolleranza periferica al FVIII negli emofilici A gravi

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STUDIO CLINICO: Ruolo dell’ indolamina 2-3 diossigenasi (IDO) nello sviluppo di inibitore in pazienti con emofilia A

versione protocollo luglio 2011

Introduzione

Gli anticorpi neutralizzanti (inibitori) il fattore VIII (FVIII) esogeno si sviluppano in circa il 15% dei pazienti emofilici (circa un terzo di quelli affetti da forma grave, FVIII<1%) che intraprendono una terapia sostitutiva1 e si associano a significativa mortalità, morbilità e peggioramento della qualità della vita2-3. Il motivo per cui solo una parte dei pazienti emofilici che vengono trattati sviluppi una risposta immune al FVIII non è noto, anche se sono da tempo noti alcuni fattori predittivi legati al paziente (gravità dell’emofilia, tipo di mutazione genica responsabile, polimorfismi del gene del FVIII e di alcuni geni regolatori della risposta immunitaria) o correlati al trattamento stesso (esposizione intensiva al FVIII all’inizio della terapia).4 L’unico approccio terapeutico attualmente disponibile per ottenere l’eradicazione dell’inibitore e ripristinare la terapia più efficace e sicura con i concentrati di FVIII (in particolare la profilassi nel bambino), è l’induzione di immunotolleranza (ITI), tramite la somministrazione ripetuta e protratta nel tempo di elevate dosi di FVIII.5 Questo trattamento, pertanto, richiede infusioni endovenose giornaliere di FVIII per lunghi periodi (da alcuni mesi fino anche a 3 anni) con numerose ripercussioni sulla qualità della vita dei pazienti. In una percentuale non trascurabile di pazienti, inoltre, il trattamento non raggiunge il suo scopo: il tasso di successo (assenza di inibitore e ripristino della normale farmacocinetica del FVIII infuso) riportato nei Registri nazionali o internazionali varia dal 51 al 76%; in un 10-20% dei pazienti si ottiene una risposta parziale (persistenza di bassi titoli di inibitore e/o anomalie della farmacocinetica del FVIII infuso, che comunque ottiene risposta clinica ed è utilizzabile per la terapia); nel restante 20-40% dei pazienti il titolo di inibitori resta tale da non consentire la terapia con concentrato di FVIII (fallimento). A fronte di ciò, per le quantità di concentrato richieste l’ITI è un trattamento estremamente costoso, i fattori predittivi di successo sono solo parzialmente definiti e i meccanismi fisiopatologici alla base del successo dell’ITI sono poco studiati, in particolare, in riferimento all’impatto del trattamento sul sistema immunitario del paziente con inibitore.6

Allo scopo di comprendere i possibili meccanismi per cui alcuni pazienti riescono a stabilire una tolleranza al FVIII esogeno somministrato e ottenere nuove informazioni riguardo allo sviluppo di inibitori nei pazienti emofilici si propone con il presente studio di indagare il ruolo di un enzima chiave nella regolazione del sistema immune, l’indolamina 2-3 diossigenasi (IDO). Il prodotto della sua attività (e della sua presenza) è una soppressione della risposta T con induzione di linfociti Treg e una presentazione tollerogenica degli antigeni da parte delle cellule presentanti l’antigene (APC).7-11

Obiettivi dello studio

L’ipotesi da verificare è se i pazienti che sviluppano inibitore non riescono a indurre una tolleranza periferica al FVIII perché: 1) non riescono a indurre IDO; oppure 2) hanno una IDO disfunzionale. L’obiettivo principale dello studio è pertanto di valutare l’induzione di IDO nelle cellule mononucleate ottenute dal prelievo di sangue periferico dei pazienti e verificare possibili differenze tra i pazienti che sviluppano inibitori rispetto a pazienti che non sviluppano inibitori al FVIII.

Analogamente si valuteranno eventuali differenze, nell’ambito dei pazienti con inibitore sottoposti a ITI, tra coloro che ottengono una completo ripristino della tolleranza al FVIII esogeno (successo), coloro che recuperano la possibilità di essere trattati con il FVIII esogeno ma non in cui persistono tracce di inibitore o la farmacocinetica non si normalizza (risposta parziale) e coloro nei quali l’ITI non sortisce alcun beneficio significativo (fallimento).

Metodologia dello studio

Disegno dello studio. Si tratta di uno studio clinico spontaneo, di coorte (caso-controllo), in aperto, non farmacologico, multicentrico.

Tipologia di pazienti. Potranno essere arruolati tutti i pazienti affetti da emofilia A grave che, sottoposti a trattamento sostitutivo con qualunque tipo di concentrato di FVIII, abbiano sviluppato inibitore anti-FVIII (casi) o, dopo esposizione adeguata (almeno 150 giorni di esposizione, ED), siano rimasti tolleranti al FVIII esogeno (controlli). Viene posto un criterio di età per l’arruolamento (età > 6 anni) esclusivamente per ragioni correlate al prelievo ematico richiesto dallo studio (circa 10 ml).

Criteri di inclusione

– Emofilici A gravi (livelli di FVIII<1%)

– Età >6 anni

– Consenso informato del partecipante allo studio (maggiorenne) o del genitore/tutore (paziente minore)

– Storia attuale o pregressa di inibitore (qualunque titolo, persistente o transitorio) o assenza di inibitore dopo almeno 150 ED a concentrato/i di FVIII

Criteri di esclusione

– Età < 6 anni

– Mancato consenso alla partecipazione allo studio

– Pazienti affetti da altra coagulopatia

– Pazienti emofilici A gravi di cui non sia nota l’anamnesi per sviluppo di inibitore

– Pazienti con malattie immunologiche o infiammatorie croniche già note

Dimensione del campione. Si conta di studiare almeno 100 pazienti, 50 con inibitore e 50 senza inibitore. Nell’ambito dei pazienti con inibitore si identificheranno quelli sottoposti a trattamento ITI, definendo sottogruppi di pazienti in relazione alla risposta a tale trattamento (successo, risposta parziale o fallimento).

La presenza in Italia di una rete attivamente funzionante ed integrata di Centri specialistici per l’emofilia (Associazione Italiana Centri Emofilia, A.I.C.E.), alla quale il Centro richiedente e gli altri Centri partecipanti allo studio afferiscono, e la disponibilità di Registri nazionali che raccolgono da questi Centri i dati clinici dei pazienti emofilici (tra i quali la presenza attuale o pregressa di inibitore e l’eventuale trattamento ITI con il regime adottato e la risposta al trattamento)12-13 consentirà di individuare agevolmente la potenziale popolazione dello studio, altrimenti non facile da arruolare a causa della relativa rarità della patologia e della sua complicanza, lo sviluppo di inibitore.

Durata dello studio: 2 anni, compreso l’arruolamento e l’analisi dei campioni.

Database dello studio. Il database dello studio verrà mantenuto presso i Centri Coordinatori dello Studio, l’Università degli Studi di Napoli Federico II, Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Centro di Riferimento Regionale per le Emocoagulopatie e l’Università di Perugia, Dipartimento di Medicina Interna, SC di Medicina Interna e Vascolare, Centro Emofilia. Responsabili della gestione dei dati saranno i Principal Investigators dei due Centri Coordinatori, il prof. Giovanni Di Minno (Napoli) e il dott. Alfonso Iorio (Perugia).

Procedure dello studio. La partecipazione allo studio non richiede al paziente visite o procedure specifiche ad hoc. In occasione delle periodiche visite programmate di follow-up presso il Centro Emofilia di afferenza, il paziente o i suoi genitori/tutori saranno informati della possibilità di partecipazione allo studio e potranno fornire il consenso informato. L’arruolamento nello studio prevederà la raccolta di dati clinci-anamnestici del paziente, con particolare riferimento alla presenza/assenza di inibitore, eventuale trattamento di ITI; ultimo titolo di inibitore noto, frequenza dei sanguinamenti, mutazione genica F8 responsabile di emofilia, aplotipo HLA (se noto). In occasione di un prelievo ematico programmato nell’ambito dei controlli presso il Centro Emofilia, accanto ai campioni di routine saranno prelevate una provetta in sodio citrato da 5 ml 0,32 mMol (1:9/vol:vol) ed una provetta da 6 ml in EDTA per le determinazioni oggetto dello studio.

Parametri da valutare. I campioni ematici saranno inviati presso un Laboratorio centralizzato (Laboratorio di Farmacologia, Università di Perugia) per l’analisi dell’espressione e dell’induzione dell’enzima IDO, dei livelli di alcune citochine pro/anti-infiammatorie (IL-6, TGFβ, IL-10, IL-17) e dei polimorfismi del gene di IDO e di TLR9 (toll-like receptor 9).

Metodi. Le cellule nucleate circolanti verranno isolate tramite centrifugazione in gradiente Ficoll-Paque Plus. Le cellule così ottenute verranno risospese in RPMI 1640 alla concentrazione di 1×106/ml e verranno messe in coltura per 48 ore a 37 °C. Le cellule saranno poi stimolate con CpGb 3μg/ml, TGFβ 10ng/ml, IFNγ 1000 UI/ml, FVIII (2 UI/ml), FVIII (10 UI/ml) Per l’analisi dell’attività di IDO (produzione di kinurenine) saranno aggiunti 5 μL di triptofano 10mM per 5 ore, dopodiché i sovranatanti saranno raccolti e conservati a -20 °C fino al momento della quantificazione delle kinurenine tramite cromatografia liquida ad elevata pressione. Saranno inoltre dosate nei sovranatanti IL-6, IL-10, TGF-β, IL-17 tramite specifici dosaggi ELISA.

Per l’analisi dell’induzione di IDO le cellule saranno raccolte e lisate in 40μl di SB+2ME ed analizzate tramite Western Blotting.

Per lo studio dei polimorfismi del gene di IDO e del TLR9 verranno utilizzate 1×106 cellule. L’estrazione del DNA sarà eseguita tramite DNeasy Blood & Tissue Kit, seguendo le istruzioni del produttore. Lo studio dei polimorfismi sarà eseguito con il metodo Bi-PASA (Bidirectional PCR amplification of specific alleles) come descritto in letteratura.14

Analisi statistica. Le caratteristiche demografiche della popolazione saranno descritte con comuni indicatori di statistica descrittiva (media e deviazione standard, mediana e range interquartile), calcolati per l’intera popolazione, e separatamente sui pazienti con e senza storia di inibitore. Questi due gruppi saranno confrontati per i parametri dello studio. Nell’ambito dei pazienti con inibitore si effettueranno delle analisi di sottogruppi relativamente alla tipologia di inibitore (high-responder/low-responder; transitorio/persistente) e alla risposta all’ITI per i pazienti sottoposti a tale trattamento (successo/risposta parziale/fallimento). Verranno utilizzati il test t di Student o test non parametrici (Mann-Whitney) per i risultati espressi come variabili continue, mentre saranno utilizzati il chi-quadrato o il testo esatto di Fisher per i risultati binari. Quando verranno confrontati più di 2 gruppi si utilizzerà l’ANOVA o il Wilcoxon test. Per stabilire l’associazione tra le caratteristiche dei pazienti con i risultati ottenuti verrà utilizzato il coefficiente di correlazione di Spearman.

Bibliografia

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4) Coppola A, Santoro C, Tagliaferri A, Franchini M, Di Minno G. Understanding inhibitor development in haemophilia A: towards clinical prediction and prevention strategies. Haemophilia 2010; 16(Suppl 1): 13-19.

5) DiMichele DM, Hoots WK, Pipe SW, Rivard GE, Santagostino E. International workshop on immune tolerance induction: consensus recommendations. Haemophilia 2007; 13(Suppl. 1): 1-22.

6) Coppola A, Di Minno MND, Santagostino E. Optimizing management of immune tolerance induction in patients with severe haemophilia A and inhibitors: towards evidence-based approaches. Br J Haematol 2010; 150: 515-28.

7) Puccetti P, Grohmann U. IDO and regulatory T cells: a role for reverse signaling and non-canonical NF-κB activation. Nat Rev Immunol 2007;7:817-823.

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10) Romani L, Fallarino F, Puccetti P et al. Defective tryptophan catabolism underlies inflammation in mouse chronic granulomatous disease. Nature 2008; 451:211-215.

11) Fallarino F, Vacca C, Orabona C, et al. Functional expression of indoleamine 2,3-dioxygenase by murine CD8 alpha(+) dendritic cells. Int Immunol 2002;14: 65-68.

12) Iorio A, Oliovecchio E, Morfini M, Mannucci PM; Association of Italian Hemophilia Centres Directors. Italian Registry of Haemophilia and Allied Disorders. Objectives, methodology and data analysis. Haemophilia 2008;14:444-53.

13) Coppola A, Margaglione M, Santagostino E, Rocino A, Grandone E, Mannucci PM, Di Minno G, for the AICE PROFIT Study Group. Factor VIII gene (F8) mutations as predictors of outcome in immune tolerance induction of patients with severe hemophilia A and high-responding inhibitors. J Thromb Haemost 2009; 7: 1809-15.

14) Carvalho A, Marquesb A, Maciela P, Rodrigues F. Study of disease-relevant polymorphisms in the TLR4 and TLR9 genes: A novel method applied to the analysis of the Portuguese population. Molecular and Cellular Probes 2007; 21:316-320.